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Tutorial : techniques d'analyse chromosomique en oncologie : caryotype, FISH et CGH

 

Introduction

Techniques d'analyse chromosomique

Détails sur la technique CGH

Comparaison des techniques cytogénétiques

Matériel requis par la CGH

Logiciels requis par la CGH

Applications de la CGH

Références

Réactions ou questions

 

par : Mario AJA Hermsen etc…

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Tutorial : Techniques d’analyse des chromosomes en oncologie : caryotype, Hybridation in situ avec marquage fluorescent (FISH) et hybridation génomique comparative (CGH)

  1. INTRODUCTION
  2. Le caryotype est depuis longtemps considéré comme une bonne technique d’analyse des tumeurs.

    Il permet aussi bien de diagnostiquer les anomalies chromosomiques quantitatives (par exemple les monosomies et les trisomies) que qualitatives, comme les délétions, les amplifications, les inversions et les translocations.

    Cette technique est cependant laborieuse et de résolution limtée. Récemment, des techniques cytogénétiques qui trouvent leur place en recherche ainsi que, déjà, dans le diagnostic des tumeurs ont été développées en alternative : l’hybridation in situ avec marquage fluorescent (FISH) et l’hybridation génomique comparative (CGH).

    Ce travail récapitule les avantages et inconvénients de ces différentes techniques, les détails des procédures, les impératifs matériels et logiciels et les possibilités d’application diagnostique, en particulier pour la plus récente d’entre elles, la CGH.

  3. TECHNIQUES D’ANALYSE DES CHROMOSOMES

Pour étudier les chromosomes des cellules (tumorales), il faut des tissus frais en phase de prolifération. Le cycle de prolifération cellulaire comprend quatre phases : la phase G1, où se prépare la réplication de l ‘ADN, la phase S, où l’ADN est synthétisé, la phase G2, où les cellules se préparent à la mitose, et la phase M, où a lieu la division en deux cellules filles. En moyenne, un cycle complet dure 24 heures. Les chromosomes ne sont visibles et analysables que pendant la très courte phase M (environ 20 minutes).

Les chromosomes sont des amas d’ADN très organisés dans lesquels l’ADN est enroulé autour de molécules protéiques. Les chromatides sœurs sont deux molécules d’ADN identiques produites pendant la phase S. Elles sont attachées entre elles au niveau du centromère, l’endroit où les filaments du fuseau les relient pendant la mitose pour tirer chacune des deux chromatides vers les cellules filles génétiquement identiques. Une cellule humaine normale contient 22 types de chromosomes différents, les autosomes, et les chromosomes sexuels. Tous les chromosomes sont organisés par paire, l’un des chromosomes provenant de l’ovule maternel, l’autre du spermatozoide paternel. Leur nombre total est donc de 46.

Pour le caryotype, les cellules sont arrêtées en phase M par la colchicine, qui détruit les filaments du fuseau mitotique et empêche les cellules de se diviser. Les cellules peuvent poursuivre le cycle et former des chromosomes, mais ne peuvent pas sortir de la phase M. Les cellules sont ensuite recueillies, traitées avec une solution hypotonique (75 mM KCl) et fixées par une solution de méthanol et d’acide acétique (3 :1). Quand une goutte de la suspension cellulaire est ensuite étalée sur une lame microscopique d’une certaine hauteur (en général 1 à 5 cm), de belles étendues du chromosome peuvent être vues.

Trois marquages différents sont utilisés pour révéler sur les chromosomes un profil de bandes spécifique permettant leur identification : la technique des bandes G par marquage au Giemsa après traitement par la trypsine est utilisée en microscopie de brillance ; la technique des bandes Q par marquage à la quinacrine est utilisée en microscopie à fluorescence ; et la technique des bandes DAPI, qui fait appel au 2,4-diamino-phényl-indole, est également utilisée en microscopie à fluorescence pour marquer l’arrière-plan des préparations dans les techniques d’hybridation.

Les anomalies chromosomiques peuvent être numériques ou structurales, les deux types d’anomalie se rencontrant simultanément dans la plupart des tumeurs.

Les modifications structurales peuvent être une délétion partielle ou une duplication, une inversion, une translocation déséquilibrée ou réciproque et une amplification. Les tumeurs, surtout les solides, peuvent avoir des caryotypes complexes révélant nombre de ces anomalies (figure 1). L’analyse cytogénétique peut fournir un aperçu des modifications de tout le génome mais elle est souvent incapable de les identifier toutes, même si le caryotype est simple. Un exemple, présenté dans la figure 4, en est fourni par le caryotype de la lignée cellulaire tumorale 92VU040, qui est dérivée d’un carcinome cellulaire squameux de la cavité orale. Il montre sur les chromosomes 3, 12 et 18 du matériel supplémentaire dont l’origine n’est pas identifiée (figure 2).

 

Figure 1 (Caryotype de la lignée cellulaire d’un carcinome squameux 92VU059)

Figure 2 (Caryotype de la lignée cellulaire d’un carcinome squameux 92VU040)

 

L’hybridation in situ avec marquage fluorescent (FISH) est également utilisée pour l’analyse chromosomique mais, contrairement au caryotype, il ne donne d’informations spécifiques que sur une seule région chromosomique à la fois. Les sondes sont des séquences d’ADN normal, contenant un marqueur fluorescent, qui peuvent se lier ou s’hybrider à des séquences d’ADN complémentaires sur les chromosomes et placer ainsi le marqueur sur cette partie du chromosome. Des sondes ont été développées pour identifier spécifiquement les chromosomes dans leur entier, les centromères, les télomères, ou des régions ou des gènes particuliers. La FISH est utilisée en recherche pour étudier la localisation exacte des translocations chromosomiques ou pour étudier les aberrations numériques au cours de l’interphase dans les tumeurs. Elles est également utilisée dans un but diagnostique pour rechercher des translocations connues, par exemple dans les leucémies.

Les sondes pour tout le chromosome ont été utilisées dans l’étude de la lignée cellulaire tumorale citée plus haut, la lignée 92VU040, pour identifier le matériel excédentaire. Des sondes pour les chromosomes 3, 12, 18 et X furent choisies (X car l’une des deux copies de X manque dans le caryotype). L’excédent sur le chromosome 3 s’est révélé être du matériel appartenant au chromosome 3 et l’excédent du chromosome 12 être en fait du matériel provenant du chromosome X (figure 3). Cependant, l’origine de l’excédent du chromosome 1 n’a pas pu être identifiée. Une nouvelle technique aurait pu réaliser l’analyse avec facilité : c’est la technique FISH avec multiple +6+q++9marquage. Cette technique, couplée à un logiciel informatique spécialisé, peut marquer tous les chromosomes avec des couleurs différentes en une seule étape. Cette technique est encore en développement mais est très prometteuse pour un avenir proche.

 

Figure 3 (Technique FISH sur des cellules tumorales 92VU040 en métaphase utilisant le marquage du chromosome X entier)

 

Une autre technique relativement nouvelle est l’hybridation génomique comparative (CGH). Elle donne des informations sur le nombre de copies des morceaux de chromosomes mais ne nécessite que de l’ADN génomique provenant de la tumeur. En bref, l’ADN tumoral est marqué avec un fluorochrome vert, mélangé avec de l’ADN normal (diploïde) et hybridé avec des préparations cellulaires en métaphase normale. Les ADN vert et rouge entrent en compétition pour s’hybrider avec les chromosomes. Le rapport de la fluorescence verte sur la rouge dans les chromosomes mesure de la sur- ou de la sous-représentation (perte ou gain, respectivement) du matériel génétique de la tumeur (figure 4). Cette technique fait elle aussi appel à des logiciels spécialisés.

 

Figure 4 (Schéma récapitulatif de la technique CGH)

 

Appliquée à la lignée cellulaire tumorale 92VU040, elle détecte le gain de 3q, le matériel Xq sur le chromosome 12, ainsi qu’un gain de 8q, qui représente le matériel excédentaire sur le chromosome 18 (figure 5). Il faut préciser que, si la tumeur avit eu une translocation équilibrée, la technique CGH n’aurait pas pu la détecter.

Les techniques décrites ci-dessus devraient donc être considérées comme des techniques complémentaires, qui fournissent des informations équivalentes amis aussi, du fait de leur particularités respectives, des informations spécifiques sur les anomalies chromosomiques des tumeurs.

 

Figure 5 (Résultats du caryotype de la lignée cellulaire tumorale 92VU040 par la technique CGH)

 

3. HYBRIDATION GENOMIQUE COMPARATIVE (CGH)

3.1 Introduction

En collaboration avec le groupe de Joe Gray, de l'Université de Californie, Kallioniemi et al ont été les premiers à publier la CGH comme une nouvelle technique d'analyse chromosomique (Kallioniemi et al., 1992). Cependant, cette technique paraissait difficile à reproduire dans d'autres laboratoires, moins spécialisés. Ce n'est qu'après la publication d'un article décrivant la méthode de façon très détaillée que la CGH devint plus accessible (Kallioniemi O. et al., 1994).

A l'heure actuelle, beaucoup de travaux ont été menés sur la CGH réalisée sur de nombreux types de tumeurs solides, utilisant des lignées cellulaires tumorales, des tissus frais ou congelés et des tissus formolés et inclus en paraffine (Cher et al., 1994 ; Speicher et al., 1994 ; Schrock et al., 1994 ; Ried et al., 1994 ; Tarkkanen et al., 1995 ; Hermsen et al., 1997 ; Larramendy et al., 1997). Les deux dernières sources de tissu offrent l'opportunité d'étudier des tumeurs pour lesquels on dispose des données cliniques, ce qui permet d'établir des relations entre les altérations génétiques et un pronostic. Dans les paragraphes suivants, toutes les étapes de la CGH seront expliquées en détail.

3.2 Préparation des métaphases normales

Les préparations de métaphases normales sont obtenues à partir de cultures de lymphocytes du sang périphérique d'un sujet normal stimulés par de la phytohémagglutinine.

Après 3 jours de culture, les cellules sont bloquées en mitose par de la colchicine, recueillies, traitées par une solution hypotonique de KCl et fixées dans un mélange de méthanol et d'acide acétique. Les cellules sont montées sur les lames de façon à ce que les chromosomes des cellules en mitose soient bien étalés. Il est important de tester plusieurs échantillons de métaphases dans la CGH, parce que leur comportement au cours de l'hybridation peut être très variable.

Il est également possible d'acheter chez un fournisseur des lames de métaphases préparées et testées.

3.3 Extraction de l’ADN tumoral

En commençant avec un minimum de 200 000 cellules ou environ 1mm3 de tissu, l'ADN tumoral peut être obtenu par tout type d'extraction d'ADN permettant de disposer d'ADN de haut poids moléculaire, utilisable pour la CGH. L'ADN normal utilisé comme référence peut être obtenu à partir des lymphocytes sanguins de tout individu sain. Les tissus frais ou congelés fourniront la meilleure qualité d'ADN pour les techniques de marquage, mais l'ADN des tissus inclus en paraffine, qui peut être en partie dégradé, peut également être utilisé.

La qualité de l'ADN provenant des tissus paraffinés dépend beaucoup du pH du fixateur formolé, qui devrait être de 7, et du temps de fixation : plus ce temps est court, meilleur est l'ADN. En général, une série de 10-20 coupes de 10 µm est suffisante pour obtenir 4 à 20 µg d'ADN, en fonction de la taille du tissu. La ou les parties les plus représentatives du tissu peuvent être micro-disséquées de ces coupes en grattant et en recueillant le matériel dans des tubes Eppendorf. Une période d'incubation prolongée (3 jours) en tampon de lyse et en présence de fortes concentrations de protéinase K (ajoutée deux fois par jour) permet d'obtenir de l'ADN en bonnes quantité et qualité.

3.4 Marquage de l’ADN

Unetechnique standard (nick translation) est utilisée pour marquer l'ADN et obtenir des fragments d'une longueur optimale de 500 à 1500 paires de bases. Une faible quantité (0.5 à 1 µg) d'ADN est suffisante. Les désoxynucléotides conjugués à la digoxygénine et biotinylés sont incorporés à l'ADN marqueur, qui nécessite une étape de détection après hybridation avec des anticorps conjugués à un fluorochrome (respectivement conjugué avidine-FITC et et conjugué de chèvre anti-digoxygénine-TRITC). Il est aussi possible d'utiliser directement des désoxynucléotides conjugués à un fluorochrome, qui donnent un signal d'hybridation plus faible le long des chromosomes. Il est important que les fragments d'ADN marqués de la tumeur et d'ADN de référence aient la même longueur d'environ 500 à 1500 paires de bases.

3.5 Hybridation

Environ 150 à 200 ng de l'ADN tumoral et de l'ADN de référence marqués (les sondes) sont mélangés avec une quantité 100 fois supérieure d'ADN humain Cot-1, précipité et resuspendu dans 10 µl du réactif d'hybridation contenant 500% de formamide et 10% de sulfate de dextran. L'ADN Cot-1 est constitué de séquences répétitives purifiées et est ajouté pour bloquer les séquences répétées hautement polymorphiques de l'ADN. Les sondes et les lames de métaphase normale sont dénaturées séparément. L'hybridation se fait dans un incubateur humide à 37°C pendant 2 à 4 jours. Après hybridation, les lames sont lavées et contrecolorées avec du DAPI pour révéler un profil de bandes permettant l'identification du chromosome et un caryotype satndard.

3.6 Acquisition et analyse des images

Par microscopie en fluorescence, en utilisant trois filtres de bandes passantes séparées (respectivement pour DAPI, FITC et TRITC) en combinaison avec une caméra CCD, trois images digitales en noir et blanc sont capturées pour chaque métaphase et reconstituées sur l'écran d'un ordinateur. Les logiciels utilisés dans la CGH pour travailler l'image sont indiqués plus loin. Des logiciels spéciaux permettent la réalisation d'un caryotype interactif et le calcul du rapport de la fluorescence verte sur la rouge pour chaque chromosome.

De plus, les programmes d'analyse de la CGH exécutent automatiquement les étapes suivantes :

1 - soustraction de l'arrière-plan

2 - soustraction du matériel non chromosomique

3 - normalisation du rapport FITC/TRITC sur l'ensemble de la métaphase

4 - découpage des chromosomes de longueur standard

Les proportions moyennes de plusieurs métaphases soigneusement sélectionnées sont présentées près des idéogrammes des chromosomes correspondants avec le nombre de copies relatif en montrant les parties de chromosomes perdues (délétions) ou excédentaires (amplifications).

L'interprétation des profils de proportion fournit matière à discussion entre les utilisateurs de la technique CGH. Quelques-uns fixent les limites de 0.75 et 1.25 ou de 0.85 et 1.15 pour classer les pertes et les gains de matériel, tandis que d'autres utilisent les limites d'un intervalle de confiance de 95%. Dans ce dernier cas, les déviations par rapport à la normale sont interprétées comme gains ou pertes quand l'intervalle de confiance de 95% du ratio de fluorescence ne contient pas 1. Les régions chromosomiques 1p32-pter, 16p et le chromosome 19 sont considérés comme non exploitables et doivent être exclues de l'interprétation. Ceci est du au grand nombre de séquences répétitives dans ces régions, qui sont variables entre individus. L'ADN Cot-1 devrait réprimer ces séquences, qui se trouvent en plus grandes quantités au niveau des centromères et des télomères, mais il n'y parvient souvent que partiellement. Les figures 6 et 7 montrent respectivement le résultat de l'analyse par CGH d'une tumeur (carcinome du colon) versus un tissu normal , et d'un tissu normal versus un tissu normal.

Dans le contrôle normal, tous les profils de proportions sont aux alentours de 1, tandis que , dans la tumeur, de fortes déviations peuvent être observées au niveau des bras chromosomiques 7p, 8q, 13q, 20p+q (gains), et 8p, 15q, 17p, 18p+q, Xq (pertes).

Figure 6 (Résultats de la CGH d'un échantillon d'ADN normal versus normal, montrant la présence de tous les chromosomes en nombre normal)

Figure 7 (Résultats de la CGH d'un carcinome du colon, montrant les gains chromosomiques 7p, 8q, 13q, 20p+q et les pertes chromosomiques 8p, 15q, 17p, 18p+q, Xq).

L'analyse des anomalies génétiques dans les tumeurs est de plus en plus importante en pathologie tumorale. Les techniques disponibles pour ce faire incluent : l'analyse de l'ADN par cytométrie, la cytogénétique tumorale (TC), l'hybridation in situ (ISH) et le test du microsatellitisme, par exemple pour l'analyse de la perte de l'hétérozygotie (LOH). Toutes ces techniques ont des avantages et des désavantages, faisant dépendre le choix entre elles de l'anomalie à rechercher et du type de tissu disponible (Hermsen et al., 1996). Les caractéristiques de ces techniques sont comparées entre elles en utilisant 6 critères : 1) exigences concernant la source de tissu, 2) spécificité des informations obtenues, 3) sensibilité des informations (en paires de mégabases), 4) facilité de mise en œuvre, 5) rapidité de mise en œuvre, 6) relation entre les informations obtenues et l'histologie (figure 8).

 

Figure 8. Comparaison des avantages et désavantages des techniques d'analyse génétique utilisées en pathologie tumorale.

 

Analyse cytogénétique

  1. Culture cellulaire : cellules tumorales se divisant
  2. Globale : aperçu de tous les chromosomes
  3. Sensibilité : bande chromosomique (10 Mb)
  4. Facilité : nécessite beaucoup d'expérience
  5. Lente : plusieurs semaines
  6. Pas d'information reliée à l'histologie

 

Hybridation in situ avec marquage fluorescent

  1. Noyaux des tissus congelés ou paraffinés
  2. Informations spécifiques sur 1 locus ou un gène
  3. Spécificité : minimale, environ 5000 bp
  4. Facile, sauf pour tissus paraffinés
  5. Rapide : environ 2 jours
  6. Informations histologiques : peut être faite sur des sections de tissu (congelé/paraffiné)

 

Analyse de l'ADN par cytométrie de flux

  1. Noyaux congelés ou paraffinés
  2. Très globale : pas d'information sur les locus
  3. Spécificité : indice d'ADN 0.1
  4. Facile
  5. Rapide : 1 jour
  6. Aucune information reliée à l'histologie

 

Perte d'hétérozygotie

  1. ADN congelé ou inclus en paraffine
  2. Informations spécifiques sur un locus ou un gène
  3. Spécificité : minimale, environ 100 bp
  4. Facile : nécessite une formation en biologie moléculaire
  5. Rapide : 1 jour
  6. Informations histologiques : uniquement en cas de dissection tissulaire

 

Hybridation comparative génomique

  1. ADN tissulaire congelé ou inclus en paraffine
  2. Globale : aperçu de tous les chromosomes
  3. Spécificité : bande chromosomique (10 Mb)
  4. Facilité : expérience requise
  5. Moyennement rapide : 5 jours
  6. Informations histologiques : uniquement en cas de dissection tissulaire

 

Micro-CGH

  1. ADN tissulaire congelé ou inclus en paraffine
  2. Informations spécifiques sur plusieurs loci ou genes
  3. Spécificité : 40 à 100 Kb
  4. Facilité : encore en développement
  5. Moyennement rapide : environ 5 jours
  6. Informations histologiques : uniquement en cas de dissection tissulaire

4. COMPARAISON DES TECHNIQUES CYTOGENETIQUES

La cytométrie appliquée à l'étude de l'ADN est facile et rapide mais ne fournit que des informations brutes sur le contenu nucléaire en ADN.

L'analyse cytogénétique peut donner un aperçu des anomales numériques et structurales mais demande du matériel tumoral frais et (à court terme) des cellules qui cultivent, ce qui rend cette technique très consommatrice de temps avec un domaine d'applications limité. De plus, elle nécessite une grande expérience.

La FISH peut aussi fournir des données sur les aberrations numériques ainsi que sur quelques anomalies structurales. Cependant, elle donne des informations sur une région spécifique par test et ne peut pas donner d'aperçu de toutes les modifications génétiques. Elle peut être réalisée sur des chromosomes en métaphase et des noyaux en interphase à partir de tissus congelés ou paraffinés. Appliquée aux tissus paraffinés, la FISH est parfois difficile à réaliser. Son grand avantage est la possibilité de relier ses résultats aux données histopathologiques.

La LOH procure des informations sur le nombre d'allèles de régions sélectionnées. Elle est rapide, peut utiliser plusieurs sources d'ADN mais exige aussi de l'ADN normal du même patient.

La CGH est une technique intermédiaire, qui associe de nombreux avantages des autres techniques. Elle est moyennement rapide, peut utiliser de l'ADN provenant de différentes sources, l'ADN normal peut être obtenu de donneurs sains, et elle donne un aperçu de toutes les anomalies chromosomiques à travers le génome.

Le fait qu'elle ne peut pas déterter des aberrations structurales constitue un désavantage. La micro-CGH, qui est encore en développement, est identique à la CGH normale mais utilise de micro-étalements de séquences connues d'ADN (ou de gènes) à la place des chromosomes comme cibles de l'hybridation. Elle procure donc des informations sur des régions ou des gènes spécifiques et peut traiter plusieurs cibles en un seul test. Sa sensibilité est d'environ 10 à 100 fois supérieure à celle de la CGH normale.

En conclusion, plusieurs techniques sont utilisables pour analyser les anomalies génétiques dans les génomes tumoraux. Elles ont toutes des avantages et des désavantages et elles doivent être choisies en fonction des intérêts scientifiques et de la disponibilité du tissu tumoral.En de nombreux points, elles sont complémentaires, fournissant différents aspects de la réalité génétique au chercheur.

5. MATERIEL REQUIS PAR LA CGH

5.1 Caméra

La caméra utilisée pour la CGH doit répondre aux impératifs suivants (Tirkkonen et al., 1996). Elle doit offrir une résolution spatiale de 0.1 µm au niveau de l'échantillon, pour donner 600x600 pixels pour la métaphase. L'objectif doit être choisi pour obéir à cet impératif, ce qui en pratique mène au choix d'un objectif x63 ou x100, selon la résolution de la caméra. La caméra doit être capable d'intégrer le signal pour une exposition habituelle de 5 à 10 secondes sans générer de courant sombre. Une résolution photométrique de 8 bits est suffisante. La caméra doit avoir une bonne linéarité. Les plus modernes caméras CCD actuellement disponibles dans le commerce respectent ces critères. Une caméra coûteuse n'est donc pas nécessaire.

5.2 Microscope

Les objectifs doit être "plans" et apochromatiques et, comme précisé plus haut, permettre un grossissement de x63 à x100, selon la résolution de la caméra. Ils doivent transmettre la lumière UV et ne comporter aucune lentille autofluorescente. Le système doit être souvent vérifié, surtout les lentilles de type "fluar", puisqu'elles peuvent rapidement développer une autofluorescence. Si une autofluorescence se développe, l'objectif doit être remplacé. L'objectif ne doit montrer aucune aberration chromatique. La source lumineuse du microscope doit être stable ; les lampes à arc de mercure sont habituellement utilisées. La source lumineuse doit être bien alignée pour fournir un bon éclairage de l'échantillon. Un dispositif de scannographie automatique et un autofocus sont considérés comme optionnels mais peuvent aider à repérer les métaphases et à acquérir les images plus rapidement. Quelques microscopes ont davantage d'options contrôlées par l'ordinateur, comme l'exposition et le diaphragme.

5.3 Filtres

Les filtres doivent minimiser les interférences entre les 3 fluorochromes. Ceci signifie que des filtres de bandes passantes étroites sont requis pour l'excitation et l'émission. Cependant, plus la bande passante d'un filtre est étroite, moins l'intensité du signal est forte, ce qui peut générer des temps d'exposition trop longs. Les filtres doivent donc fournir le meilleur compromis entre interférences et intensité. Pour l'association de fluorochromes la plus fréquente, DAPI/FITC/TRITC, de bons filtres sont actuellement disponibles dans le commerce. Le changement de position latéral provoqué par les filtres doit être minime et m^me égal à zéro. Les systèmes de microscopes avec des ensembles de filtres qui répondent à ces spécifications sont maintenant disponibles. Une roue automatique de filtres est optionnelle mais peut permettre de travailler plus rapidement.

5.4 Ordinateur

L'ordinateur utilisé pour accueillir les logiciels de la CGH peut tourner sous UNIX ou Windows 95. Le temps de capture et d'archivage des images ne devrait pas dépasser 1 heure par préparation (10 à 20 métaphases). Un écran couleur de grandes dimensions est nécessaire pour permettre l'affichage des images en couleur et l'accès aux fenêtres de communication avec le système.

6. LOGICIELS REQUIS PAR LA CGH

Le logiciel pour la CGH doit pouvoir exécuter plusieurs taches (Piper et al., 1995). Il doit évidemment permettre la capture de 3 images en couleur (par exemple DAPI, FITC, TRITC). Après enregistrement des images, il est important de vérifier leur qualité. Ceci peut être fait en évaluant plusieurs caractéristiques.

Il faut d'abord vérifier que les séquences répétées ont été suffisamment réprimées par l'ADN Cot-1. Ceci peut être fait en évaluant l'intensité relative des régions péricentrmériques.

Deuxièmement, l'intensité du marquage par le DAPI doit être assez forte pour permettre l'analyse du caryotype et l'intensité des deux hybridations doit être assez forte pour calculer des rapports corrects. De plus, l'intensité des ADN tumoral et normal ne devraient pas être trop différents et avoir besoin d'être normalisés. Ceci doit prévenir les variations de profils de proportions dues à l'utilisation de quantités déséquilibrées d'ADN tumoral et de contrôle, qui est en pratique inévitable.

Troisièmement, le signal de l'arrière-plan doit être aussi haut que possible. Le rapport entre l'intensité du pixel le plus lumineux sur la moyenne de ceux de l'arrière-plan doit au moins être égal à 3 (Du Manoir et al., 1995).

Quatrièmement, l'hybridation doit être homogène sur la métaphase, ce qui peut être vérifié sur l'image rouge (ADN de contrôle). On vérifie aussi l'homogénéité de l'image et en particulier la régularité de l'éclairage et l'absence d'artéfacts d'hybridation. ceci peut être vérifié en calculant les centres de masse des 3 images colorées, qui ne devraient pas différer de plus que quelques pixels (Du Manoir et al., 1995).

Enfin, les signaux d’hybridation doivent être uniformes et non granulaires. La segmentation des chromosomes est assez délicate. La simple discrimination basée sur l’histogramme des niveaux de gris n’est pas satisfaisante, aussi faut-il souvent avoir recours à quelques astuces de filtrage ou de traitement des images.

Il est habituel de déterminer la segmentation des chromosomes en s’aidant à la fois du DAPI et de l’image de l’ADN de référence. S’il y a des variations latérales causées par les changements de filtres, elles seront corrigées. L’un des buts les plus importants du logiciel est d’identifier les différents chromosomes. Ceci peut prendre un certain temps, aussi peut-on recourir à un caryotype semi-automatisé pour présenter les chromosomes verticalement et rendre possible leur retournement ou leur déplacement, voire leur destruction si nécessaire. Après la segmentation des chromosomes et les corrections éventuelles, l’axe de symétrie des chromosomes peut être calculé, ce qui constitue aussi une étape difficile. Il n’est pas toujours possible de le faire automatiquement, aussi le logiciel doit-il permettre de corriger interactivement cet axe (par " rubber banding " plutôt que par dessin libre). Il faut en général corriger le niveau de la fluorescence d’arrière-plan. Si l’arrière-plan n’est pas homogène, il faut faire une correction locale.

On peut ensuite calculer les rapports de proportion des chromosomes et standardiser leur longueur : on analyse les profils de proportion de plusieurs copies d’un même chromosome (de préférence 10 à 20) et on en fait la moyenne pour obtenir des résultats valables par la CGH. Ces résultats sont considérés comme ceux d’un nombre relatif de copies de caryotypes, et l’on affiche les profils moyens de proportion de fluorescence près des idéogrammes des chromosomes (voir figure 6). La plupart des systèmes donnent un intervalle de confiance de 95% autour des profils de proportion de fluorescence pour aider à détecter les pertes et les gains (pour lesquels l’intervalle de confiance ne contient pas de rapport égal à 1) et fournir une validaion statistique à l’interprétation des gains et des pertes.

7. APPLICATIONS DE LA CGH

7.1 Introduction

On utilise en général en recherche la CGH comme technique de dépistage pour détecter les aberrations chromosomiques impliquées dans le développement d’une tumeur. Depuis 1992, la CGH a fourni un nouvel éclairage sur la génétique de nombreux types de tumeurs hématologiques et solides, surtout celles qui étaient difficiles à cultiver et qui étaient très rares (refs). De plus, des anomalies chromosomiques récurrentes détectées par la CGH à différents stades de la tumorigénèse, comme les lésions précancéreuses, les carcinomes invasifs et les métastases, ont dirigé les chercheurs vers des oncogènes ou des gènes suppresseurs qui doivent jouer un rôle dans la rapidité d’évolution de la tumeur débutante ou dans le développement des métastases. La CGH a par ailleurs été utilisée pour étudier différents constituants histologiques intratumoraux et a permis une meilleure compréhension des relations entre phénotype et génotype. La CGH est également appliquée à l’étude de tissus tumoraux archivés, provenant de patients dont les données du suivi clinique à long terme sont connues. Ceci permet donc de corréler des anomalies chromosomiques spécifiques au devenir clinique de la tumeur et d’aider à l’établissement du pronostic. Dans les paragraphes suivants, nous montrerons des exemples des possibilités d’application de la CGH à l’étude de la pathogénèse des tumeurs ainsi que quelques applications cliniques, largement basées sur les travaux de notre propre laboratoire.

7.2 Pathogénie

7.2.1 Cancer du poumon

La figure 9 montre la synthèse des résultats de l’analyse par CGH de 53 cancers pulmonaires non ganglionnaires (Hermsen et al., 1998a). Chaque trait à droite de l’idéogramme représente une tumeur avec un gain ou une amplification dans cette région, et chaque trait sur la gauche représente une tumeur avec une perte ou une délétion dans cette région. Cette figure montre aussi les informations de la cytométrie en flux, les lignes pointillées étant les tumeurs diploïdes et les lignes pleines les tumeurs aneuploïdes. Un tel aperçu montre immédiatement que certaines régions chromosomiques sont très fréquemment touchées, comme 1q, 8q et 17p, tandis que d’autres ne sont impliquées que dans quelques tumeurs, comme 4p, 10, 14 et 15. On voit également très vite que quelques régions chromosomiques sont préférentiellement touchées dans les tumeurs aneuploïdes, comme 9q, 11q13, 17q, 20q (gains) et 8p (pertes). Ces régions sont connues pour porter des gènes tumoraux importants, comme c-myc sur 8q, cycline D1 sur 11q13, c-erB2 sur 17q et p53 sur 17p. Les gains sur la région 20q13 ont été reliés à la récidive des cancers pulmonaires (Isola et al., 1995) et d’importants travaux sont en cours pour trouver l’oncogène responsable dans cette région (Tanner et al., 1994).

 

Figure 9 (Aperçu des résultats de la CGH sur 53 cancers pulmonaires non ganglionnaires)

 

Quand nous avons comparé ces résultats à ceux des mesures quantitatives (index ADN, index mitotique et surface nucléaire) connues pour leur valeur prédictive, nous avons trouvé une relation entre la survenue des gains de 8q, 11q13, 17q et 20q et un mauvais pronostic. A ce jour, la corrélation avec le devenir clinique réel n’est pas encore significative mais le deviendra dès que la période de suivi aura atteint 5 ans.

      1. Tumeurs multidifférenciées

Nous avons appliqué la CGH à l’étude de la génétique des tumeurs qui ont plus d’un aspect histologique (Torenbeek et al., 1998). La figure 10 montre une tumeur nasopharyngée avec un aspect spinocellulaire et un aspect carcinomateux. Il s’agissait de déterminer si la lésion provenait de la rencontre de deux tumeurs distinctes se développant indépendamment ou si l’un des constituants était un sous-clone dérivant de l’autre.

Dans le premier cas, nous avions prévu un profil d’anomalies chromosomiques complètement différent pour les deux constituants, et, dans le deuxième, un haut pourcentage de similitudes entre les deux. L’ADN des deux parties a été soigneusement disséqué à partir de coupes de 10 µm et le résultat de la CGH est donné dans la figure 11. Il est clair que la majorité des modifications chromosomiques se retrouve dans les deux constituants, ce qui exclue l’éventualité qu’ils représentent deux entités distinctes. Cette analyse montre également que de grandes différences phénotypiques ne s’accompagnent pas obligatoirement de grandes différences chromosomiques.

 

Figure 10 (Coupe histologique d’une tumeur nasopharyngée montrant un constituant spinocellulaire et un constituant épithélial)

Figure 11 (Résultats de la CGH sur les deux constituants de la tumeur nasopharyngée)

7.2.3 Tumeurs du colon

Dans le même ordre d’idée, nous avons étudié quelques tumeurs colorectales qui montraient différents stades de malignité, par exemple une partie invasive et une partie adénomateuse. Nous avons trouvé que, dans la majorité des cas, la partie invasive comportait les mêmes anomalies que la partie adénomateuse mais aussi des anomalies supplémentaires.

      1. Résumé

Finalement, nous utilisons la CGH dans une grande étude destinée à améliorer l’évaluation du risque cancéreux chez les patients porteurs d’adénomes colorectaux et à éclaircir les changements génétiques impliqués dans le développement des carcinomes colorectaux. A ce jour, les patients porteurs d’adénomes sont considérés comme un groupe à haut risque de développement d’un cancer colorectal. Cependant, on estime que seuls 5% d’entre eux développent actuellement ce type de cancer.

Il est donc important d’identifier les patients porteurs d’adénomes qui sont réellement à haut risque de développer un cancer. Dans l’étude présentée, nous avons analysé les aberrations chromosomiques des adénomes de patients ayant différents profils de risque. Nous avons distingué les patients avec adénomes multiples, avec adénomes et carcinomes synchrones et avec des adénomes présentant un foyer de carcinome. De plus, nous avons étudié les carcinomes de ces patients. Jusqu’à maintenant, 72 échantillons tumoraux ont été analysés au total. Après microdissection des régions tumorales à étudier à partir de séries de coupes paraffinées de 10 µm, l’ADN a été recueilli et analysé par CGH (Hermsen et al., 1998b). En général, les adénomes montrent moins d’anomalies chromosomiques que les carcinomes. Dans un certain nombre de tumeurs, aucune aberration n’a pu être mise en évidence par la CGH. En outre, les aberrations observées dans les adénomes se révélaient très aléatoires. Seuls les gains des chromosomes 7 et 13q survenaient à une fréquence d’environ 30%, alors que, dans les carcinomes, les pertes de 8q, 17p et 18q et les gains de 7q, 8q et 13q survenaient respectivement à des fréquences de 50 et de 70%. Chez les patients présentant de multiples lésions, nous n’avons jusqu’à maintenant pas trouvé de similitudes probantes en gains et pertes chromosomiques entre les individus.

Pour éliminer l’influence du bruit de fond génétique quand nous interprétions les résultats des adénomes, nous nous sommes intéressés aux gains et pertes chromosomiques qui survenaient aussi à haute fréquence dans les cancers colorectaux, c’est-à-dire les gains de 8q et 13q et les pertes de 8q et 18q, que nous avons qualifiés de " mauvais évènements ". Parmi les adénomes étudiés, les zones adénomateuses des polypes malins ont montré de façon significative le plus haut taux de fréquence pour ces " mauvais évènements " (figure 12). De plus, une corrélation significative a été constatée entre la fréquence des " mauvais évènements " dans les adénomes et leur grade de dysplasie (figure 13).

Par contre, aucune corrélation n’a pu être trouvée entre la fréquence des " mauvais évènements " et la taille des adénomes ou leur type histologique (tubulaire, tubulovilleux ou villeux), en dépit du fait que les adénomes villeux sont considérés comme à très grand risque d’extension du cancer. Bien que le nombre de tumeurs analysées à ce jour soit encore insuffisant pour tirer des conclusions péremptoires, il est clair que ces premiers résultats sont prometteurs.

 

Figure 12 (Nombre de " mauvais évènements " par cas dans les adénomes colorectaux de patients à différents profls de risque)

Figure 13 (Nombre de " mauvais évènements " par cas dans les adénomes colorectaux à des grades croissants de dysplasie)

 

Dans la seconde étape du projet, nous analyserons dans une étude cas-contrôles les adénomes archivés ayant un suivi à long terme. Un groupe d’adénomes provient de patients qui ont ultérieurement développé un cancer, et l’autre groupe de patients qui n’en ont pas développé..

7.3 Applications cliniques

7.3.1 Introduction

Les applications cliniques de la CGH sont la classification diagnostique des tumeurs, l’évaluation du risque des lésions paranéoplasiques et le pronostic des cancers, le diagnostic différentiel entre les métastases et les deuxièmes cancers primitifs et l'identification des localisations primitives en cas de métastases et de 2 (ou plus) tumeurs primitives.

      1. Classification des tumeurs
      2. Il ne fait aucun doute qu’une classification adéquate des tumeurs est cruciale pour prendre des décisions cliniques. En anatomopathologie, un certain nombre de techniques peuvent y aider, si la morphologie seule ne permet pas de conclure. Ce sont l'histochimie, l'immuno-histochimie, la morphométrie et la stéréologie, la cytométrie de l’ADN, la microscopie électronique et différentes techniques de biologie moléculaire. Mais ces différentes techniques ne permettent pas toujours non plus d’arriver à une conclusion. Dans ce cas, la CGH peut être d’un grand apport, comme le rapporte clairement le tableau 1, qui montre les plus fréquents gains et pertes détectés par la CGH dans les différentes tumeurs. Quelques évènements sont presque communs, comme un gain de 1q, mais quelques autres semblent plus ou moins spécifiques, comme les gains de 4p et 8q dans le cancer du poumon et la perte de 9p dans le cancer transitionnel de la vessie. Naturellement, beaucoup de travaux sont encore nécessaires pour corréler au mieux les données sur les diagnostics différentiels cliniquement les plus importants, mais on peut déjà imaginer que la CGH pourra dans quelques cas jouer un rôle.

         

        Tableau 1. Gains et pertes trouvés par la CGH dans différents types de cancers.

      3. Prévisions pronostiques
      4. Les résultats de la CGH ont été comparés aux grades et aux stades du cancer transitionnel de la vessie (TCC), comme le montre le tableau 2 (). Les TCC de grade 1 avaient en moyenne 2 chromosomes altérés, ceux de grade 2 en avaient 2.6 et ceux de grade 3 en avaient 7.5. Les stades tumoraux Ta, T1, T2, T3 avaient respectivement en moyenne 1.0, 2.8, 2.5 et 5.2 chromosomes altérés. Ceci démontre que le nombre d’évènements décelés par la CGH est corrélé avec le stade et le grade du TCC de la vessie et qu’il peut être utile pour déterminer plus fiablement le grade et établir un pronostic.

         

        Tableau 2. Corrélation entre le nombre de chromosomes altérés trouvé par la CGH et le grade et le stade du cancer transitionnel de la vessie.

        Dans le cancer du poumon, nous avons trouvé, dans une étude portant sur 53 patients porteurs d’un cancer non ganglionnaire, que les gains de 8q, 11q, 17q et 20q survenaient significativement plus fréquemment dans les cas présentant des caractéristiques de pronostic défavorable (surface nucléaire élevée, index mitotique élevé, aneuploïdie de l’ADN) (Hermsen et al., 1998a). Bien que nous ne disposions pas encore d’un suivi suffisant pour analyser la survie, ceci indique que ces évènements détectés par la CGH peuvent avoir une signification pronostique dans cet important sous-groupe de patients. Isola et ses collaborateurs (Isola et al., 1995) ont montré, dans leur étude sur 48 cancers du poumon, qu’un grand nombre de gains et de pertes (et en particulier le gain de 20q) était associé à la récidive et à une courte survie.

      5. Diagnostic différentiel entre métastase et deuxième tumeur primitive
      6. Supposons que nous nous trouvions face à un patient chez qui un cancer fut diagnostiqué il y a quelques années et qui présente à l’heure actuelle une autre tumeur. Il est parfois difficile de déterminer s’il s’agit d’une métastase ou d’une seconde tumeur primitive. Ceci arrive par exemple souvent en cas de carcinome du larynx à cellules squameuses. L’étude morphologique et l’immunochimie ne sont habituellement pas utile dans ce cas, mais une analyse moléculaire ou cytogénétique comme la CGH peut aider puisqu’on peut comparer le profil cytogénétique des deux tumeurs. Par exemple, quand la première tumeur montre un gain de 1q et 3q et une perte de 17p et que la seconde montre u gain de 11q et des pertes de 10q et 17p, on peut en conclure que cette dernière est une deuxième tumeur primitive (les pertes de 17p, où se situe p53, est un événement fréquent et non spécifique).

      7. Identification de la localisation primitive en cas de métastases et de 2 (ou plus) tumeurs primitives

De même, quand on a dans le passé diagnostiqué 2 tumeurs primitives chez un patient qui présente maintenant des métastases, la CGH peut être utile pour déterminer l’origine des métastases. Par exemple, quand la première tumeur montre un gain de 1q et 3q et une perte de 17p, que la seconde montre un gain de 5q et des pertes de 10p et 17p et que les métastases montrent un gain de 1q et une perte de 17p, on peut en conclure que la métastase est dérivée de la première tumeur.

Nous avons utilisé la CGH dans une situation analogue dans un cas d’autopsie avec de multiples tumeurs. Il s’agissait d’une femme âgée de 76 ans chez qui on avait diagnostiqué un cancer invasif du poumon droit 10 ans auparavant. Elle présentait lors de l’admission des métastases adénocarcinomateuses multiples, en particulier au niveau du pancréas et des ganglions sus-claviculaires. Elle se détériora rapidement et mourut avant qu’un traitement efficace ne soit institué. L’autorisation de l’autopsier fut obtenue et la principale question qui se posait au point de vue clinique était de savoir si l’on avait affaire à un nouveau cancer pancréatique ou à des métastases multiples du cancer du poumon. L’autopsie confirma les multiples localisations de la tumeur cancéreuse dans les ganglions sus-claviculaires et le pancréas et mit en évidence une petite lésion dans le poumon droit, sur le site de l’opération chirurgicale antérieure. L’étude microscopique montra que toutes les lésions tumorales étaient adénocarcinomateuses, avec un haut degré de formation tubulaire dans la tumeur pulmonaire mais avec un aspect presque complètement solide et parfois une différenciation annulaire dans la tumeur pancréatique et les métastases ganglionnaires. Une analyse immuno-histochimique approfondie fut menée en incluant BRST2, les récepteurs des stéroïdes et CA 19.9, mais elle ne se révéla pas concluante. Puisque nous n’arrivions pas à savoir s’il s’agissait d’une récidive du cancer pulmonaire avec des métastases ganglionnaires et pancréatiques ou s’il s’agissait d’un cancer pulmonaire associé à un cancer pancréatique primitif métastasiant, nous avons décidé de faire une CGH sur les 3 localisations.

Le tableau 3 récapitule les différents gains et pertes trouvés dans les tumeurs pulmonaire et pancréatique et les métastases ganglionnaires.

 

Tableau 3. Aperçu des gains et pertes trouvés par la CGH dans de multiples tumeurs d’un même patient

 

En résumé, les tumeurs pancréatique et pulmonaire avaient en commun 50% d’évènements, la tumeur pancréatique et les métastases ganglionnaires 32%, et la tumeur pulmonaire et les métastases ganglionnaires 41%. Nous en avons donc conclu qu’il ne s’agissait que d’une seule et même tumeur. Du fait qu’une lésion pulmonaire avait été trouvé sur le site de l’intervention chirurgicale antérieure, nous avons considéré qu’il s’agissait vraisemblablement d’une récidive du précédent cancer pulmonaire avec des métastases dans les ganglions sus-claviculaires et le pancréas. Malheureusement, nous n’avons pas pu examiner le cancer pulmonaire primitif.